프로토콜 변환 - 샘플 변환 프로토콜

플라스미드를 이용한 박테리아의 형질전환은 박테리아 연구에서 주목할 뿐만 아니라 포유류 세포의 유전자 발현 연구에도 사용될 수 있다. 대부분의 플라스미드는 박테리아 기원이며 복제의 박테리아 기원과 selectable marker로 사용될 수 있는 항생제 내성 유전자를 모두 포함한다. 형질전환 과정은 세포에 외부 DNA가 도입되도록 한다.

유전자 변형은 변형에 더 잘 적응하도록 다양한 박테리아 균주에 이루어질 수 있다. 그러한 변형은 플라스미드 DNA를 재배열하지 않고 플라스미드를 유지할 것이다. 특정한 치료는 박테리아의 transformation efficiency을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 치료는 그것들을 화학적 또는 전기적 기반의 변형에 더 민감하게 만들고, 흔히 'competent cells.'이라고 불리는 것을 생성한다

박테리아의 형질전환 효율성을 향상시키기 위해, 배양 전 단계는 실제 형질전환 과정 전에 통합될 수 있다. 배양 전 단계는 박테리아 세포에 특정 성장 조건을 부여하거나 스트레스를 유도하는 것을 포함하는데, 이는 박테리아가 외부 DNA를 흡수하는 능력을 향상시킨다. 이러한 배양 전 단계를 주의 깊게 최적화함으로써, 연구자들은 박테리아 형질전환의 효율성을 상당히 향상시킬 수 있어 다운스트림 적용에서 더 나은 결과를 허용한다.

선택적으로 선별된 DNA 염기서열을 분리, 증폭 및 전파하는 능력은 양 돌리와 같은 잘 알려진 복제 예를 넘어 광범위한 실용적인 적용을 제공하는 생물학에서 기본적이다. 박테리아의 고전적인 특성인 플라스미드와 제한핵산분해효소를 활용함으로써, DNA 복제는 원하는 DNA 염기서열의 증폭을 가능하게 한다.

박테리아 내에서 일반적으로 발견되는 플라스미드는 클로닝 목적을 위해 몇 가지 유리한 특성을 갖는다. 그들은 염색체 DNA와 별개로 자율적으로 복제할 수 있으며, 전형적으로 이중 가닥이고 구조가 원형이다. 이러한 원형의 특성은 그들이 외부 DNA를 수용하기에 이상적으로 만들고, 결과적으로 재조합 플라스미드의 형성을 초래한다. 이러한 재조합 플라스미드는 그들 자신의 DNA와 증폭될 선택된 DNA 세그먼트의 혼합물을 포함한다. 추가적으로, 플라스미드는 제한 엔도뉴클레아제, 복제 기원 및 kanamycin 또는 ampicillin 저항성과 같은 선택 가능한 마커와 같은 필수 성분을 운반한다.

재조합 플라스미드의 형성 이후, 이들은 형질전환이라고 불리는 과정을 통해 박테리아로 다시 도입될 수 있다. 전형적으로, 이는 종종 열 충격의 인가를 통해 박테리아 세포를 유능하게 렌더링함으로써 달성된다. 이 기술은 세포막을 약화시켜 박테리아에 의한 재조합 플라스미드의 흡수를 용이하게 한다.

형질전환 후, 플라스미드 또는 벡터의 성공적인 흡수를 위해 박테리아를 선별하거나 선별할 수 있다. 이것은 일반적으로 박테리아 육수를 한천에 도금함으로써 달성된다. 예를 들어, 관심 유전자가 IL-18 프로모터인 시나리오를 생각해 보자. 이 프로모터는 플라스미드 상의 LacZ 유전자에 삽입될 수 있는데, 이는 β-갈락토시다제를 암호화한다. 정상적으로 β-갈락토시다제는 X-Gal을 분해하여 푸른색의 콜로니를 만들 수 있다. 그러나 관심 유전자가 성공적으로 삽입되면 β-갈락토시다제의 발현을 방해하여 한천 플레이트에 콜로니가 흰색으로 나타나게 된다.

이러한 확립된 기술을 확장함으로써 연구자들은 박테리아 변환 프로토콜을 활용하여 생물학적 연구 및 그 이상의 다양한 응용을 위해 특정 DNA 서열을 조작하고 증폭할 수 있다

*이는 변환 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다

• 유능한 세포
• LB 한천
• SOC 매체
• 항생제(카나마이신/암피실린)
• 확산자
• 문화요리
• 37°C의 쉐이커 인큐베이터
• 캐비닛 인큐베이터 37 °C
• 37 °C의 수조
• 원심분리기
• 얼음

1. 대장균주 DH5 알파는 플라스미드 DNA를 증폭하기 위해 사용되었다
2. 세포들은 염화칼슘 방법에 의해 유능하게 만들어졌다.
3. 변환되지 않은 DH5 알파를 LB(Luria Bertani) 한천(10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl, pH 7.0)에 15g/L 한천으로 보충하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
4. 잘 정의된 DH5 알파 콜로니를 LB 한천 플레이트에서 뽑아 200rpm으로 흔들면서 5ml LB (10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl)에서 밤새 성장시켰다.
5. 하룻밤 배양물의 1ml를 LB로 150ml로 희석하고 0.4~0.6의 OD600이 될 때까지 성장시켰다.
6. 세포는 800g에서 10분간 4℃에서 원심분리하여 수확하였다
7. 얼음으로 식힌 멸균된 0.1M CaCl2 10ml에 다시 매달고 얼음 위에서 5분간 배양하십시오.
8. 세포를 재중심분리한 후 0.1M CaCl2 2ml와 DMSO 70 μl를 첨가하여 세포를 다시 부유시켰다.
9. 세포는 얼음 위에서 15분 동안 재 배양되었다. -80 ℃에서 200 μl의 양을 저장하였다

1. 냉동된 유능한 세포들은 얼음 위에서 해동되었다.
2. 100파운드의 박테리아가 해동되었다.
3. 이어서, 원하는 플라스미드 2 μl를 첨가하고, 세포/플라스미드 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다.
4. 플라스미드 흡수는 42 °C에서 40초 동안 세포에 열충격을 가함으로써 유도되었으며, 이후 얼음에서 2분 동안 회수되었다.
5. 이후 500 μl의 LB를 첨가하고, 항생제 내성 유전자의 발현을 허용하기 위해 세포를 저교반(220 rpm) 하에서 1시간 동안 배양하였다.
6. 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 선별하기 위해 암피실린(100×1080g/ml)이 포함된 LB 한천 플레이트에 100 μl의 세포를 도금하였다.
7. 접시를 뒤집어서 37°C에서 밤새 배양했다.

1. 콜리 XL1 단일 콜로니를 5ml LB 배지에 접종하고 37°C의 쉐이커에서 밤새 배양하였다.
2. 5 ml 배양액을 100 ml LB 배지에 멸균된 250 ml 플라스크에 넣고, 600 nm(OD600 nm)에서의 흡광도가 0.6 AU가 될 때까지 37℃의 쉐이커에서 배양하였다.
3. 배양물을 50ml 튜브로 옮기고 얼음에서 10분 동안 냉각시켰다.
4. 시료는 1700RCF에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다.
5. 박테리아 세포 펠렛은 dH2O에서 2 ml 40% 글리세롤에 펠렛을 재현탁시킴으로써 글리세롤 스톡을 제조하기 위해 사용되었다.
6. 100 μl를 1.5 ml 튜브에 할당하고 액체 질소를 사용하여 스냅 냉동하고 -80 °C에서 보관하였다.
7. 플라스미드 DNA로 형질전환하기 전에 콜리 XL1의 글리세롤 스톡을 -80 °C 저장고에서 제거하고 2700 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화함으로써 유능하게 만들었다.
8. 상층액을 제거하고, 펠렛을 10 μl의 TfbI Buffer (30 mM 아세트산칼륨, 100 mM 루비듐 클로라이드, 10 mM 염화칼슘, 50 mM 망간 클로라이드, 15 % (v/v) 글리세롤, 초산이 있는 pH 5.8, 필터 멸균)에 재현탁하고, 얼음 위에서 15 분간 배양하였다.
9. 현탁액을 2700RCF에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후 펠렛을 10 μl의 TfbII 버퍼(10 mM MOPS, 75 mM 염화칼슘, 10 mM 루비듐 클로라이드, 15%(v/v) 글리세롤, NaOH가 있는 pH 6.5)에 재현탁하였다.