Western Blot 프로토콜 및 문제 해결 가이드

웨스턴 블랏 프로토콜의 첫 번째 단계는 세포나 조직에서 단백질을 추출하는 것이다. 관심 단백질은 분리 겔을 통해 이동하기 위해 가용화되어야 한다.

사용되는 용해 완충제의 선택은 필요한 단백질의 산출량과 단백질의 세포 내 위치에 따라 달라진다. SDS(sodium dodecyl sulfate)와 다른 이온성 세제를 포함하는 용해 완충제(Lysis buffer)는 단백질 수율이 가장 높은 것으로 간주되며 샘플에 가장 큰 손상을 줍니다. 또한 사용되는 용해 완충제는 네이티브 또는 변성된 단백질 형태와 관련하여 프로토콜에서 항체 선택에 추가적인 영향을 미친다는 것에 유의해야 한다.

SDS를 포함하는 용해 완충제는 단백질에 변성 효과를 주는 반면, NP-40 및 Triton X-100과 같은 약한 비이온성 세제나 세제가 없는 완충제는 항체가 고유한 구조에서만 단백질을 인식할 때 사용되어야 한다. 항체가 인식하는 단백질 형태에 대한 정보는 제조업체에서 제공하는 데이터 시트에서 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용의 보존이 필요할 때 이온성 및 비이온성 세제가 없는 완충제를 사용해야 한다는 점에 유의해야 한다. 이는 기계적 전단에 의해 달성될 수 있다.

* 모든 버퍼는 4C에서 몇 주 동안, -20C에서 최대 1년 동안 저장할 수 있습니다.

RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) buffer는 배양된 세포에서 단백질을 용해 및 추출하는데 사용되며, RIPA buffer는 전체 세포 추출물 및 막 결합 단백질에 이상적인 세포 용해 시약입니다. RIPA 완충제는 단백질-단백질 상호작용을 방해하기 때문에 면역침전 분석에 이상적이지 않을 수 있다.

NP-40 버퍼는 세포질, 막 결합 및 전체 세포 추출물의 추출에 널리 사용된다. NP-40은 RIPA 버퍼보다 약한 버퍼로 간주된다.

일단 세포 용해가 일어나면 단백질 분해도 일어난다. 단백질 분해 및 탈인산화를 방지하려면 검체를 항상 얼음 위에 보관해야 합니다. 단백질분해효소 및 포스파타아제 억제제는 이 과정을 늦추기 위해 용해 완충제에 첨가된다. 이러한 억제제는 용해 완충액에 매번 신선하게 첨가되어야 합니다.

선택된 에피토프가 접힌 구조의 표면에 존재할 수 있기 때문에, 어떤 경우에 사용되는 항체는 고유한 상태의 단백질을 인식할 것이다. 이 경우 샘플을 변성할 필요가 없으므로 SDS와 샘플은 제외해야 합니다. 또한, ß-mercaptoethanol 및 DTT와 같은 환원제는 로딩 버퍼 및 마이그레이션 버퍼에서 제외되어야 합니다.

특정 단백질은 항체가 효과적으로 작동하기 위해 변성을 필요로 한다. 열변성은 단백질을 펼치고 항체가 단백질의 3D 입체구조 내에 위치한 해당 에피토프를 결합할 수 있게 한다. 단백질 변성은 변성제가 함유된 로딩 버퍼(예: 95-100°C에서 5분 동안 가열되는 SDS)를 사용하여 달성할 수 있다

웨스턴 블랏 샘플의 표준 로드 버퍼는 2x Lameli Buffer입니다. 라멜리 완충제는 무작위 코일 구성을 채택하고 단백질을 변성시키기 전에 이황화 결합을 감소시키는 작용을 하는 베타-2-메르캅토에탄올 또는 디티오트라이톨(DTT)을 함유한다. 라멜리 완충제는 또한 샘플을 더 밀도 있게 만들기 위해 글리세롤 외에도 겔 전기영동에 필요한 음전하를 제공하는 SDS 성분을 가지고 있다.

단백질의 이동을 시각화하기 위해 로딩 버퍼에 작은 음이온 염료 분자(예: 브로모페놀 블루)를 포함하는 것이 일반적이다. 염료는 음이온성이고 크기가 작기 때문에 분리될 혼합물의 구성 요소 중 가장 빠르게 이동하고 분리 진행을 모니터링할 수 있는 마이그레이션 프론트를 제공합니다.

샘플이 용해되면, 단백질 농도가 결정되고 샘플에 추가된 로딩 버퍼가 겔 전기영동에 의해 분리될 수 있다.

웨스턴 블랏을 위한 SDS-PAGE 젤에는 두 부분이 있다. 분해 및 적층 젤입니다. 젤의 아래쪽 및 더 큰 부분을 분해 젤이라고 합니다. 이것은 먼저 주입됩니다. 분해 겔이 설정되면(1시간 허용) 적층 겔을 추가할 수 있습니다. 스태킹 젤은 분해 젤 위에 부어집니다. 이 젤에 빗을 넣습니다. 이 두 겔의 기본적인 화학적 성질은 동일하지만 아크릴아마이드의 농도와 pH만 다를 뿐이다.

겔에 사용되는 아크릴아마이드의 백분율은 관심 단백질의 크기와 겔에 필요한 기공의 크기에 따라 달라진다. 일반적으로, 작은 단백질의 경우 높은 비율의 겔을 사용해야 하고, 큰 단백질의 경우 낮은 비율의 겔을 사용해야 한다. 아크릴아미드의 사용량이 증가할수록 기공 크기가 감소한다는 점에 유의해야 한다. 아래 표는 선형 분리 범위를 기준으로 권장되는 백분율 겔을 개략적으로 설명되어 있습니다.

젤은 살 수 있지만, 많은 연구 그룹들은 그들만의 젤을 만드는 것을 선호한다. 아래는 젤을 10% 적층하고 젤을 분해하는 샘플 레시피입니다.

모든 실험과 마찬가지로 검사가 정확하고 민감하며 효율적인지 판단하려면 양성 및 음성 컨트롤을 사용해야 합니다. 겔이 균일하게 로딩되었는지 확인하기 위해 로딩 컨트롤도 사용해야 합니다.

다양한 분자량 마커를 사용하면 단백질 크기(아래 참조)를 결정하고 전기영동 실행을 모니터링할 수 있습니다.

전기영동 후, 단백질은 겔로부터 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 막으로 전달되어야 한다. 가장 널리 사용되는 전달 방법은 전기 용출 또는 전기영동 전달이다. 이 방법은 단백질과 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막 사이의 소수성(hydrophobicity) 및 정전기 전하에 의존하여 단백질 전달의 효과를 결정한다.

단백질 함유 겔은 전사막과 직접 접촉하여 전도성 용액에 잠긴 2개의 전극 사이에 끼워진다. 전기장이 가해지면 단백질은 겔에서 이동하여 막에 부착된다. 막은 이제 폴리아크릴아미드 겔에서 관찰된 단백질 패턴의 복사본이다.

*참고 - 취급 및 박리는 관심 단백질을 제거할 수 있으므로 항상 가장 약한 항체를 먼저 조사하는 것이 가장 좋습니다.

항체가 추가되기 전에 검출 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 막을 차단해야 합니다. 막을 차단하면 검사의 감도와 신호 대 잡음비가 향상됩니다. 우유와 BSA는 가장 일반적으로 사용되는 차단제이다.

일부 항체가 우유에 비특이적으로 결합하는 것으로 나타났기 때문에 사용되는 차단제는 항체에 의존할 것이다. 인산화에 민감한 항체로 프로빙할 때 BSA를 사용하는 것이 권장된다.

만약 당신의 1차 항체가 말, 소, 염소, 당나귀에 대해 만들어졌다면, 당신의 소 단백질 BSA나 우유는 교차 반응이나 IgG 오염의 가능성 때문에 막을 막는 데 사용될 수 없다는 것에 주목하는 것이 중요하다.

결합되지 않은 시약을 제거하고 배경을 줄이려면 웨스턴 블랏의 세척 단계가 필요합니다. 제대로 세척하지 않으면 배경 소음이 높을 수 있으며, 너무 많이 세척하면 얼룩에서 항원이 용출될 수 있습니다.

세척 버퍼에 사용되는 세제의 양은 Twinte 20과 같은 세제의 경우 0.05 ~ 0.5%의 농도로 측정값에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어 세제의 신선한 재고를 만드는 것이 좋습니다. 미생물의 성장에 따라 20에서 20 사이에 높은 배경 소음이 발생할 수 있습니다. 또한, 세제에는 과산화물이 포함되어 있으므로 고순도 세제의 사용이 필수적이다

비특이적 결합을 방지하기 위해 막이 차단되면 이제 1차 항체로 검사할 수 있다. 좋은 1차 항체는 단백질 그룹의 특정 단백질 또는 에피토프를 인식한다. 사용되는 항체는 조사 중인 단백질에 따라 달라집니다.

1차 항체를 선택할 때는 종에 따라 에피토프 특유의 항체 종이 다를 수 있는지 여러 가지 고려해야 한다, 항체/항체 상호작용은 변성 조건과 변성 후 변형에 민감할 수 있으며, 마지막으로 모든 일차 항체가 웨스턴 블랏에 적합한 것은 아니며 검증이 필요할 수 있다.

일차 항체 배양 후 세척 완충액으로 5분 동안 막을 5회 x 5회 세척해야 합니다

일반적으로 1차 항체는 검출할 수 없기 때문에 1차 항체를 결합하고 표적 항원의 검출을 가능하게 하는 라벨링된 2차 항체를 사용해야 한다. 사용된 2차 항체의 선택은 1차 항체가 자란 종 또는 1차 항체(예: 비오틴, 히스티딘)와 연결된 태그에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1차 항체가 변형되지 않은 토끼 모노클로널 항체인 경우, 2차 항체는 비마우스 숙주의 항마우스 2차 항체여야 한다.

위에서 언급한 바와 같이, 2차 항체는 서로 다른 현상 분자에 결합되어 있으며, 필름 검출 및 화학 발광 HRP 또는 AP가 일반적으로 사용되며, 레이저 포획을 위해서는 형광체가 필요하다.

항체가 사용되어야 하는 희석은 제조업체에서 일반적으로 권장합니다. 그러나 항체의 최적 희석은 검사의 사양에 따라 달라질 수 있습니다. 더 강하게 발현된 단백질과 높은 민감도의 분석은 더 약하게 발현된 단백질과 덜 민감한 분석에 비해 더 적은 항체를 필요로 할 것이다. 적은 양의 항체를 사용하면 배경 소음이 감소하고 특이성이 증가합니다. 항체 희석은 일반적으로 세척 완충액에서 이루어집니다.

2차 항체의 라벨 유형에 따라 사용되는 개발 시스템이 결정됩니다. 효소적으로 표지된 항체, 예를 들어 HRP 및 AP의 경우 화학 발광 방법이 필요하다. 공액 형광체가 사용된 경우 형광 스캐닝 장치를 즉시 사용할 수 있다.

HRP 공액 항체는 가장 널리 사용되며, HRP 효소의 크기가 작기 때문에 효소와 항체 모두의 특이적 활성 및 공액 반응과의 호환성 때문에 AP 공액보다 우수한 것으로 간주된다. 또한, HRP 기판은 높은 활성률과 안정성을 제공할 뿐만 아니라 널리 이용 가능하다.

AP는 선형 반응 속도를 가지지만 필요한 반응 시간이 증가하면 종종 높은 백그라운드 신호와 낮은 신호 대 잡음비를 초래할 수 있다.

HRP/AP 결합체에서 생성된 신호는 일시적이며 효소-기질 반응이 일어나는 동안에만 지속된다. 항체 희석의 잘 최적화된 분석과 충분한 기질은 X선 필름 또는 디지털 이미징 장비를 사용하여 문서화할 수 있도록 1 - 24시간 동안 빛을 생성할 수 있습니다. X선 필름을 사용하여 반정량 데이터를 얻을 수 있지만 디지털 이미징은 광범위한 동적 범위를 감지하고 서부 블랏에 대한 정량적 데이터 검색을 가능하게 한다. 화학 발광 블랏에서 얻은 신호는 가변적이며 일반적으로 반정량적으로 간주된다.

형광 포어 결합 항체는 프로토콜을 훨씬 더 짧게 만드는 기질이 사용되지 않기 때문에 더 적은 단계를 필요로 한다. 그러나 여기 광원이 필요한 신호를 감지하려면 전문 장비가 필요합니다. 적외선, 근적외선 및 양자점의 개발은 웨스턴 블랏 분석을 위해 조사된 형광의 민감도를 증가시켰다.

화학 발광 검출보다 형광 검출을 사용하는 것의 장점은 둘 이상의 형광 포어를 사용하여 다중화할 수 있다는 것이다. 또한 형광 블랏은 반복 실험에 걸쳐 정량적이고 일관된 결과를 가능하게 한다. 형광 검출의 단점으로는 자동 형광의 결과로 인한 낮은 신호 대 잡음비 및 charged-couple 장치 카메라 사용 시 낮게 발현된 단백질을 증폭시키지 못하는 것을 들 수 있다.

웨스턴 블랏 막에서 1차 및 2차 항체를 제거하는 것을 스트리핑이라고 한다. 스트리핑을 통해 검사자는 블랏에서 하나 이상의 단백질(예: 관심 단백질 및 로딩 제어)을 살펴볼 수 있습니다. 프로빙은 또한 여러 대상에 사용될 수 있으며 시간과 샘플을 절약하기 때문에 유리하다.

스트리핑은 PVDF 막에서 가장 잘 작동하는데, 이는 단백질이 용질이 아닌 부착 상태를 유지하는 더 큰 능력을 가지고 있기 때문이다. ECL과 같은 화학 발광 시약은 비슷한 분자량의 표적을 탐지하는 데 방해가 될 수 있는 막을 더럽히지 않기 때문에 박리를 위해 권장된다. 막이 얼마나 많이 벗겨지고 얼룩질 수 있는지는 박리 프로토콜이 얼마나 최적화되어 있는지에 달려 있다.

박리 후에는 완충막을 철저히 하고 1차 항체 배양 전에 차단하는 것이 중요하다.

스트리핑 버퍼에는 순하거나 가혹하게 사용할 수 있는 두 가지 강도가 있습니다.

가벼운 박리 완충제는 결합된 항체를 해리시키기 위해 낮은 pH의 글리신 용액을 사용한다. 낮은 pH는 활성 부위의 구조적 변화 및 비활성화를 통해 결합된 항체를 제거하는 작용을 한다.

거친 스트리핑은 주로 신호 강도가 높은 블롯에 사용된다. 거친 스트리핑 버퍼는 또한 항체 구조를 변경하고 표적 단백질을 방출하기 위해 낮은 pH에 의존한다. 거친 완충액에서 이 활성은 베타-메르캅토에탄올 및 SDS와 같은 환원제를 포함하는 중성 Tris-HCl 용액을 사용하여 달성된다. 이 용액은 50~80°C에서 교반과 함께 최대 45분 동안 블랏으로 가열된다. SDS와 베타메르캅토에탄올의 활성이 역전되지 못하고 박리된 항체가 회복된다는 점에 유의해야 한다. 또한, 재프로빙 항체의 변성을 방지하기 위해 거친 완충제를 사용한 후에는 철저한 세척이 필요하다.

겔 전기영동에 의한 단백질의 분리는 두 가지 방법으로 시각화할 수 있다: 쿠마이스 염색 또는 구리 염색. 사용되는 염색의 선택은 단백질의 다운스트림 적용에 크게 의존한다.

쿠마이스 염색은 단백질이 균일하고 균일하게 이동했는지 여부를 결정하는 데 사용된다. 쿠마시 염색은 전도가 목적이 아닌 가역적이지 않은 쿠마시 염색으로 SDS-Page 분리 결과를 관찰하는 경우에만 젤에 사용해야 합니다.

시각화 후 단백질을 전달하려면 구리 염색을 사용해야 합니다. 구리 염색은 쿠마이스 염색보다 빠르고 민감하다고 한다.

PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막을 Ponceau Red로 염색함으로써 전달의 효율과 성공을 평가할 수 있다. 폰세오레드로 염색하면 세척 시 쉽게 반전되므로 후속 항체 검사가 가능합니다.

차단 버퍼, lammeli 버퍼, 로딩 버퍼, 실행 버퍼, 전송 버퍼 및 스트리핑 버퍼를 포함한 모든 필수 웨스턴 블롯 버퍼에 대한 레시피를 아래에서 확인하십시오.